成功可視化嵌入冰中的樣品的一個先決條件是，在短時間內(nèi)將水分子固定在適當?shù)奈恢?，不允許形成冰晶，理想情況下會形成無定形凍結（玻璃化）水。在沉浸式凍結的情況下，只有使用具有高導熱性的合適制冷劑，并且快速浸入樣品以確保整個樣品快速冷凍，才能實現(xiàn)嵌入冰中的樣品的可視化。合適的制冷劑包括液化乙烷、丙烷或二者的混合物^[1]，使用溫度略高于熔點（分別為-183℃，純化合物為-188℃）。此外，標本內(nèi)的任何一點到暴露于制冷劑的表面的距離必須短，即樣品必須非常薄。

冷凍TEM中的標本載體必須為標本提供良好的支撐，但幾乎沒有背景來進一步降低典型未染色冷凍樣品的低對比度。它們還必須導電，以避免標本帶電和相關問題，如漂移。所有這些要求在一定程度上都可以通過帶有穿孔碳膜的標準TEM網(wǎng)格（實驗室制造或商用）得到滿足。后者具有非常規(guī)則大小和位置的孔，便于自動數(shù)據(jù)采集?？赡苄枰褂幂x光放電/等離子體清洗或基質(zhì)蛋白涂層對網(wǎng)格進行預處理，以允許水溶液均勻擴散或細胞附著。

對于基本沉浸式凍結，用鑷子固定在類似切紙機的裝置中（圖1），涂抹少量（3–5µl）水溶液中的標本，并用濾紙吸干溶液的主要部分，以減少殘留層的厚度。這一步驟對于玻璃化（見上文）和達到顯微鏡電子束可穿透的厚度都是必要的，對于大多數(shù)樣品，無需采取進一步的制備步驟。精確的厚度取決于樣品和可用的顯微鏡，通常冰層要盡可能薄，但厚度不超過500nm.這也在所述技術可以有效凍結的厚度范圍內(nèi)。

吸干后，立即將樣品迅速放入制冷劑中。冷凍后，樣品可以轉(zhuǎn)移到液氮中，在顯微鏡檢查之前幾乎無限期地儲存。

一個關鍵問題是通過足夠快的冷卻來生產(chǎn)玻璃狀冰，但也要將冰保持在這種無定形狀態(tài)：后者要求樣品保持在再結晶溫度以下?？梢酝ㄟ^將網(wǎng)格保持在液氮以下或在冷氮氣氣體環(huán)境中，并預冷卻操作冷凍標本所需的所有工具達到目的。

另一個主要問題是冷凍標本的表面因濕度冷凝而受到污染，從而形成納米尺寸的冰晶。由于樣品將被冷凍成像并作為一個整體（與冷凍替代或Tokuyasu冷凍切片等通過后續(xù)處理步驟去除表面晶體的方法相比），這種污染將在TEM中作為高對比度特征而明顯，因此必須避免。這可以通過一些措施來實現(xiàn)，旨在降低周圍大氣的濕度和樣品暴露在該大氣中的時間：通常，最好是在除濕室，樣品應保持在液氮以下，必須避免在樣品表面呼吸，所有轉(zhuǎn)移應使用清潔工具在液相上方的干燥（和冷）氮氣環(huán)境中快速進行，顯微鏡必須通過特殊的防污染裝置在目標區(qū)域提供清潔的真空。

然而，即使是冷凍的樣品，如果在冷凍前的瞬間處理不當，也無法產(chǎn)生有意義的結果。問題的一個潛在來源是，如圖1所示，儀器上的標本溫度不受控制：位于含有液氮的容器上方的未定義位置，樣品可能暴露在室溫或冷氣體中，導致不良狀態(tài)。

在同一類型的儀器上，尤其是在上述推薦的濕度較低的房間中工作時，溶劑的蒸發(fā)可能會產(chǎn)生問題：根據(jù)^[2]，在室溫和30%的環(huán)境濕度下，水以50nm/s的速率從薄膜中蒸發(fā)。溶劑的去除以及隨后鹽類和其他溶質(zhì)的富集顯然會嚴重影響從含水標本中獲得的結果。

盡管經(jīng)驗豐富的研究人員可以使用圖1所示的基本工具取得非常有意義的結果，但上面提到的許多問題仍未解決。因此，實驗室已經(jīng)開始建造自己的儀器，包括環(huán)境室和自動吸干器。隨后，不同制造商推出了商業(yè)產(chǎn)品（回顧請參見^[3]），包括徠卡顯微系統(tǒng)公司與維也納IMP/IMBA電子顯微鏡設施合作開發(fā)的徠卡EM GP沉浸式凍結裝置（圖2）。