圖 2。 概括了對(duì)含有多種熒光染料的樣本成像時(shí)的三種顏色分離方法。 通過(guò)比較發(fā)現(xiàn),與傳統(tǒng)熒光成像方法相比,F(xiàn)luoSync 采集速度更快的優(yōu)勢(shì)顯而易見。FluoSync 捕捉受激發(fā)染料的全發(fā)射光譜,因此光子不會(huì)被浪費(fèi),這使它成為敏感活體樣本弱光成像的理想探測(cè)技術(shù)。圖 3。 左側(cè)所示為藍(lán)色、綠色和紅色熒光團(tuán)的三個(gè)單獨(dú)光譜。 使用相量分析時(shí),每個(gè)純光譜都落入相量空間中的特定空間,顏色在一個(gè)圓圈上表示,信號(hào)清晰度決定了與中心(中間面板)的距離。 這些熒光團(tuán)的任意組合也將落入特定空間。 圖中所示是三個(gè)熒光團(tuán)中的每一個(gè)與所有三個(gè)熒光團(tuán)的混合體的一種組合。 由于任何可能的熒光團(tuán)組合也將落入“它們的"空間,因此可將光譜平均化以實(shí)現(xiàn)去噪。 右側(cè)圖是一個(gè)例子,其中黑線表示平均值 ± 誤差(顯示為灰色區(qū)域)。 降噪光譜表示所有貢獻(xiàn)熒光團(tuán)的總和,它很好地填充了曲線下方的面積通過(guò)相量來(lái)表示光譜信息,可對(duì)圖像中的不同熒光組分進(jìn)行實(shí)時(shí)、半盲的光譜分解。這種表示方法不僅局限于熒光標(biāo)記,還可以去除自發(fā)熒光等無(wú)用信號(hào),因此比線性拆分更加可靠?;谙嗔康墓庾V拆分方法適合用于分解最多 3 個(gè)熒光團(tuán)的信號(hào)。超過(guò) 3 個(gè)熒光團(tuán)時(shí),相量方法仍然可以輕松識(shí)別最大的影響因素。拆分領(lǐng)域的新發(fā)展催生了一種混合拆分方法,它結(jié)合了基于相量的拆分和線性拆分這兩種方法的優(yōu)點(diǎn)。
對(duì)混合光譜拆分的說(shuō)明
FluoSync 充分利用了基于相量的拆分與線性拆分混合方法的優(yōu)勢(shì)。相量分析用于相似光譜的快速聚類以及光譜去噪和線性拆分,能夠識(shí)別染料對(duì)每個(gè)聚類的單獨(dú)貢獻(xiàn),甚至包括超過(guò) 3 種染料的情況(圖3)。與單純基于相量的拆分類似,具有相似熒光組分的所有像素都會(huì)落入相同的相量空間。因此,無(wú)論空間位置(即圖像中的原點(diǎn)位置)如何,它們都可被平均化以實(shí)現(xiàn)光譜去噪。 這樣,通過(guò)歧管進(jìn)行的線性拆分操作次數(shù)(像素?cái)?shù),通常在百萬(wàn)像素級(jí)別)通常會(huì)減到少于100,000次操作。然后對(duì)降噪光譜進(jìn)行線性拆分,由此識(shí)別每種染料的亮度值。與線性方法相比,混合拆分方法利用了基于相量的方法所具有的速度和平均化優(yōu)勢(shì),而不會(huì)影響可分離染料的數(shù)量。
總結(jié)與優(yōu)勢(shì)
FluoSync是光學(xué)濾色鏡的數(shù)字迭代進(jìn)步。這是一種可用于對(duì)多種染料成像的可靠方法。由于它只需要單次圖像曝光,并且可以使用自動(dòng)光譜分解方法完成,因此可以更輕松、更快速地進(jìn)行多色熒光成像。
與傳統(tǒng)成像技術(shù)相比,F(xiàn)luoSync 提供了高速、同步的多通道采集,同時(shí)利用了串?dāng)_而不是避免串?dāng)_。它是掃描大型樣本或捕捉活細(xì)胞快速動(dòng)態(tài)過(guò)程的理想解決方案。最后,使用 FluoSync 時(shí)無(wú)需在實(shí)驗(yàn)之間管理多組熒光濾色塊,從而簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)工作流程。因此,您可以專注于獲得結(jié)果,而不是研究顯微鏡。
優(yōu)勢(shì):
> 可使用不同的熒光團(tuán)組合更加自由地進(jìn)行多通道成像:您不再受限于使用與顯微鏡的固定濾光鏡組匹配的染料組合。
> 提升數(shù)據(jù)生成效率: 能同時(shí)采集所有事件而無(wú)需管理多組濾光鏡,從而加快了圖像采集過(guò)程,提高了對(duì)多孔板等大型樣本成像的效率,并且能夠捕捉活體樣本中的快
速事件。
> 增強(qiáng)信心:使用混合光譜拆分方法意味著您無(wú)需再擔(dān)心串?dāng)_。
參考資料
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