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熒光和量子點(diǎn)的基本原理和發(fā)展歷史

更新時(shí)間:2023-04-11      點(diǎn)擊次數(shù):936

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在您的科研生涯的某個(gè)時(shí)候,都有可能會(huì)用到熒光顯微鏡。這種無處不在的技術(shù)改變了顯微鏡學(xué)家對(duì)研究對(duì)象進(jìn)行成像、標(biāo)記和追蹤的方式,不論是整個(gè)生物體,還是單個(gè)蛋白質(zhì)等等。
通過本文,我們將探討什么是“熒光",包括其定義背后的歷史和基礎(chǔ)物理原理,綠色熒光蛋白(GFP)的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用,并展望量子點(diǎn)等熒光探針不斷擴(kuò)大的應(yīng)用領(lǐng)域。


我們?nèi)绾味x“熒光"?
在任何搜索引擎中輸入“熒光的定義",你會(huì)得到以下語(yǔ)句,或者非常相似的內(nèi)容;
“由較短波長(zhǎng)的入射輻射,如X射線或紫外線,某些物質(zhì)會(huì)發(fā)出可見或不可見的輻射。"
這個(gè)定義與熒光顯微鏡(圖1)有何關(guān)聯(lián)呢?“波長(zhǎng)較短的入射輻射"只是用來“激發(fā)"樣品發(fā)射熒光的光源。這種光線包括可見光、紫外線(UV)和紅外線(IR),顯微鏡的光源可以是汞或氙弧光燈,也可以是激光。熒光基團(tuán)(即上述定義中的“某些物質(zhì)")是具有特殊性質(zhì)的化合物,它們?cè)谳^短波長(zhǎng)光線的激發(fā)下,可以再次發(fā)射較高波長(zhǎng)的光線/光子。

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圖1:熒光顯微鏡下顯示的熒光標(biāo)記細(xì)胞。
波長(zhǎng)的基本單位是米,“波長(zhǎng)"定義為光波的兩個(gè)連續(xù)波峰或波谷之間的距離。波長(zhǎng)的符號(hào)是希臘字母λ(l)。顯微鏡使用的波長(zhǎng)通常以納米(nm)為單位,可見光譜段在400至700納米之間,紫外光譜段在400納米以下,紅外光譜段從700納米開始(圖2)。

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圖2:可見光光譜
熒光基團(tuán)按其激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)分類,通常以圖形的形式顯示最大波峰。熒光基團(tuán)在所謂的“基態(tài)"中自然穩(wěn)定。它們吸收到(來自“較短波長(zhǎng)"入射光的)光子時(shí),光子的能量將熒光基團(tuán)的電子提升到更高能量的“激發(fā)"狀態(tài)。被激發(fā)的電子不會(huì)保持在這種狀態(tài),而會(huì)失去振動(dòng)能量,并在返回基態(tài)時(shí)發(fā)射出一個(gè)較長(zhǎng)波長(zhǎng)的光子。對(duì)于顯微鏡使用熒光基團(tuán),從激發(fā)到返回基態(tài)的一個(gè)完整周期需要0.5到20納秒。
熒光基團(tuán)的激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)通??s寫為希臘字母lambda,加上下標(biāo)“ex"(激發(fā))或“em"(發(fā)射;即lex或lem)。
每個(gè)熒光基團(tuán)都有一個(gè)不同的最大激發(fā)和發(fā)射譜段,這一特性用來區(qū)分同一樣品中的不同標(biāo)靶。例如,使用熒光染色劑DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚)高亮顯示細(xì)胞中的核蛋白,同時(shí)使用熒光標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽來高亮顯示肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架。
熒光的雅布隆斯基圖
波蘭物理學(xué)家亞歷山大·雅布隆斯基(Aleksander Jablonski,1898-1980)首先用三能級(jí)能量圖描述了基態(tài)/激發(fā)/發(fā)射之間的循環(huán),因此稱為“雅布隆斯基圖"。  1930年,他憑借題為《關(guān)于激發(fā)光波長(zhǎng)變化對(duì)熒光光譜的影響》的論文獲得華沙大學(xué)博士學(xué)位。1933年,他在《自然》雜志上發(fā)表了自己的論文(《染料中反斯托克斯熒光的效率》"),其中含有雅布隆斯基圖。這種簡(jiǎn)單而有效的示意圖清晰表現(xiàn)出熒光基團(tuán)從基態(tài)到激發(fā)態(tài)的激發(fā)行為,然后在發(fā)射較長(zhǎng)波長(zhǎng)光子后回到基態(tài)(圖3)。

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圖3:熒光雅布隆斯基圖。熒光基團(tuán)會(huì)吸收光子。光子的能量將熒光基團(tuán)的電子提升到更高能量的“激發(fā)"狀態(tài)。隨后,激發(fā)的電子失去振動(dòng)能量,并在返回基態(tài)時(shí)發(fā)射一個(gè)較長(zhǎng)波長(zhǎng)的光子。
 
雖然圖3是簡(jiǎn)化版的雅布隆斯基圖,但應(yīng)該可以注意到,熒光基團(tuán)可以存在多個(gè)不同的激發(fā)和發(fā)射狀態(tài)。此外,熒光基團(tuán)可以通過不同的弛豫狀態(tài)返回基態(tài),這些弛豫狀態(tài)被稱為“三重態(tài)",具體取決于分子的電子自旋。
斯托克斯位移
喬治·加布里埃爾·斯托克斯爵士(1819-1903)是愛爾蘭數(shù)學(xué)家和物理學(xué)家,他一生中在光學(xué)和光線領(lǐng)域頗有建樹。1849年他受命擔(dān)任劍橋彭布羅克學(xué)院的盧卡斯數(shù)學(xué)教授,并一直擔(dān)任該職務(wù),直到1903年離開。他寫了一篇文筆優(yōu)美的描述性論文,發(fā)表于1852年,名為《論光的折射性的變化》[1]。他在論文中使用的語(yǔ)言不同于我們?cè)诂F(xiàn)代科學(xué)文獻(xiàn)中使用的語(yǔ)言。以下是斯托克斯爵士所用精彩語(yǔ)言的兩段簡(jiǎn)短摘錄;
“去年深秋,雖然因?yàn)楣?jié)氣遲來,觀察機(jī)會(huì)不多,我從不同渠道得知,之前提到過的那種具有高內(nèi)色散性的黃色玻璃采用氧化鈾染色。"
以及:
“看到試管在浸入不可見光線的瞬間點(diǎn)亮,這當(dāng)然是一個(gè)奇怪的景象:那實(shí)際上是可見的黑暗。總的來說,這種現(xiàn)象有點(diǎn)不可思議。"
“斯托克斯位移"這詞就是為了紀(jì)念這位科學(xué)家。當(dāng)激發(fā)的電子回到基態(tài)并發(fā)出光子時(shí),其波長(zhǎng)始終大于激發(fā)熒光基團(tuán)的入射光線的波長(zhǎng)。這是由于光的特性,即波長(zhǎng)與輻射能量成反比。斯托克斯位移描述了熒光基團(tuán)的峰值激發(fā)波長(zhǎng)和峰值發(fā)射波長(zhǎng)之間的差值(以納米為單位)(圖4)。

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圖4:斯托克斯位移發(fā)射光的波長(zhǎng)始終大于用來激發(fā)熒光基團(tuán)的光線波長(zhǎng)。
增加斯托克斯位移,熒光基團(tuán)的激發(fā)光和發(fā)射光之間區(qū)別就越明顯。熒光基團(tuán)的電子排布和分子結(jié)構(gòu)令其在斯托克斯位移方面有著*的性質(zhì)。
綠色熒光蛋白的發(fā)現(xiàn)與應(yīng)用
斯托克斯爵士首先使用“熒光"這個(gè)術(shù)語(yǔ)來描述他觀察到的現(xiàn)象,但其發(fā)現(xiàn)可以追溯到1565年。來自西班牙的醫(yī)生兼植物學(xué)家尼古拉斯·莫納德斯(Nicolas Monardes)描述了一種墨西哥樹(Lignum nephriticum),其木頭被注入了奇怪的藍(lán)色。盡管有這些早期的觀察,但直到約400年后,人們才在活體組織中找到一種綠色熒光物質(zhì)。1955年,Davenport和Nicol發(fā)表論文[2],描述了一種在稱為水螅水母(Hydromedusae)的水母亞綱生物的嗜酸性粒細(xì)胞中找到的發(fā)光組織。當(dāng)時(shí),兩位論文作者并沒有意識(shí)到這些嗜酸性粒細(xì)胞含有綠色熒光蛋白(GFP)。
直到1962年,下村脩(Osamu Shimomura,出生于1928)發(fā)表了一篇論文[3],認(rèn)定這種發(fā)光成分是一種蛋白質(zhì)。通過與他在普林斯頓大學(xué)的老師(弗蘭克·*教授)合作,他們從生物發(fā)光水母Aequorea Victoria(維多利亞多管發(fā)光水母)身上收集到樣本。他們用一種*的方法從水母中分離出熒光蛋白,即通過棉布袋擠壓分離的生物發(fā)光組織,產(chǎn)生一種被下村稱為“擠壓物"的溶液。
1994年,哥倫比亞大學(xué)的馬丁·查爾菲(Martin Chalfie,出生于1947年)教授發(fā)表論文,證明了基因編碼GFP可以在原核細(xì)胞和真核細(xì)胞(即大腸桿菌和秀麗隱桿線蟲的神經(jīng)元)中實(shí)現(xiàn)功能表達(dá)[4]。該論文寫道“由于這種熒光不需要外源底物和輔助因子,GFP表達(dá)可以用于監(jiān)測(cè)生物體內(nèi)的基因表達(dá)和蛋白質(zhì)定位。"正是這篇文章的發(fā)表為GFP在生物學(xué)研究中的廣泛應(yīng)用鋪平了道路。

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圖5:線蟲,GFP在神經(jīng)系統(tǒng)中的表達(dá)。
一年后,一直在研究野生型GFP突變體的加州大學(xué)圣迭戈分校教授錢永健(1952-2016)在《自然》的科學(xué)通訊上發(fā)表了自己的論文[5]。錢教授和他的同事發(fā)現(xiàn),他們選擇的一個(gè)單點(diǎn)突變(S65T)具有最長(zhǎng)的激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)(490/510nm),這令它更具有光穩(wěn)定性,并帶來大家都知道的GFP激發(fā)/發(fā)射峰。
2008年,下村脩、錢永健和查爾菲因在GFP的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用方面發(fā)揮的重要作用共同獲得諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。下村脩在他的諾貝爾演講中表示,“當(dāng)我在1979年發(fā)現(xiàn)GFP的發(fā)色團(tuán)時(shí),我認(rèn)為自己已經(jīng)完成了所有研究工作,因而決定終止我在GFP方面的工作,以便集中精力研究生物發(fā)光"。他接著承認(rèn),“GFP是一種美麗的蛋白質(zhì),但在發(fā)現(xiàn)之后的30年中,它依然百無一用。"
自從錢永健發(fā)現(xiàn)GFP的應(yīng)用之后,他的實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)設(shè)計(jì)出多種GFP變體,涵蓋了大部分的可見光譜,并*改變了光學(xué)顯微鏡和成像領(lǐng)域。得益于這種基因工程,GFP的色彩范圍從光譜的藍(lán)色譜段(EBFP;380/460納米)到光譜的黃色譜段(YFP;514/527納米)。
報(bào)告基因和探針
除了成像領(lǐng)域,熒光團(tuán)可以作為研究細(xì)胞和生物體中基因表達(dá)的“報(bào)告基因"。熒光素酶以及基因編碼GFP,就是檢查細(xì)胞是否表達(dá)特定基因的常用報(bào)告基因。生物體或細(xì)胞被基因改造的病毒DNA或質(zhì)粒轉(zhuǎn)染,當(dāng)目標(biāo)基因獲得表達(dá)時(shí),這些質(zhì)粒會(huì)發(fā)出熒光。細(xì)胞內(nèi)部的相關(guān)細(xì)胞器或位點(diǎn)可以在受轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中進(jìn)行觀察和檢查。
利用熒光基團(tuán)標(biāo)記(或“標(biāo)注")的抗體通常稱為“熒光探針"。在GFP和其他熒光基團(tuán)得到廣泛應(yīng)用之前,兩種常用的熒光基團(tuán)標(biāo)記抗體是FITC(異硫氰酸熒光素)和TRITC(異硫氰酸四甲基羅丹明)。盡管FITC和TRITC仍在使用,但該領(lǐng)域已取得重大進(jìn)展,至少可以說,熒光基團(tuán)和探針的選擇非常廣泛。
當(dāng)然,如今實(shí)驗(yàn)室中使用最為廣泛的熒光基團(tuán)之一是“Alexa Fluor"染色劑。目前Alexa Fluor染色劑的可用色彩范圍已超越可見光譜,其中激發(fā)波長(zhǎng)范圍可達(dá)346至784納米。
量子點(diǎn)
1981年,俄羅斯科學(xué)家阿列克謝·?;颍ˋlexey Ekimov)在圣彼得堡瓦維洛夫國(guó)立光學(xué)研究所工作時(shí),第一次在玻璃基質(zhì)中發(fā)現(xiàn)了量子點(diǎn)。然而,在新澤西州AT&T貝爾實(shí)驗(yàn)室從事半導(dǎo)體工作的路易斯·布魯斯(Louis Brus)首先發(fā)現(xiàn)了量子點(diǎn)膠體溶液。他現(xiàn)在是哥倫比亞大學(xué)化學(xué)系教授。在1983年和1984年發(fā)表的兩篇論文中,布魯斯將量子點(diǎn)描述為“小型半導(dǎo)體微晶"。
量子點(diǎn)有著奇特的行為方式,盡管它們包含100到10萬個(gè)原子,但它們表現(xiàn)出的性質(zhì)就像它們由單個(gè)原子組成一樣。當(dāng)然,它們確實(shí)符合熒光基團(tuán)的性質(zhì),即它們可以吸收光能并激發(fā),然后在返回基態(tài)時(shí)釋放光子。不過,量子點(diǎn)發(fā)射光線的波長(zhǎng)取決于量子點(diǎn)的大小,即量子點(diǎn)越小,發(fā)射波長(zhǎng)就越短。這種特性是因?yàn)檩^小的量子點(diǎn)具有較大的“最小帶隙"。這正是激發(fā)電子到更高能態(tài)所需的能量。由于較小的量子點(diǎn)需要更多的激發(fā)能量,它們隨后會(huì)發(fā)射較短波長(zhǎng)的光(波長(zhǎng)與激發(fā)能量成反比)。
大約20年后,即2002年,加州量子點(diǎn)公司的生命科學(xué)研究人員實(shí)現(xiàn)了量子點(diǎn)的商用開發(fā)。
量子點(diǎn)是一種非常明亮且穩(wěn)定的熒光工具。研究表明,量子點(diǎn)的的亮度比傳統(tǒng)熒光基團(tuán)高幾個(gè)數(shù)量級(jí),盡管與有機(jī)染料相比,量子點(diǎn)的明亮程度存在一些差異[6]。就光穩(wěn)定性而言,量子點(diǎn)的穩(wěn)定性是傳統(tǒng)熒光基團(tuán)的100倍,在一項(xiàng)活體成像研究中,量子點(diǎn)的熒光持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)達(dá)4個(gè)月[7]。
在傳統(tǒng)熒光探針中,一個(gè)或多個(gè)熒光基團(tuán)可以附著在單個(gè)相關(guān)抗體上。然而,由于量子點(diǎn)的表面積非常大,許多分子和抗體可以附著在單個(gè)量子點(diǎn)上,這會(huì)帶來許多優(yōu)點(diǎn),包括熒光信號(hào)放大。量子點(diǎn)的使用也為多重分析提供了優(yōu)勢(shì),可以在檢測(cè)中同時(shí)對(duì)各種波長(zhǎng)進(jìn)行成像。在這種分析中,變量是研究者選擇的量子點(diǎn)大小(因此發(fā)射波長(zhǎng))。可以使用白光同時(shí)激發(fā)大范圍的量子點(diǎn),這樣就可以避免使用多道激光和多次調(diào)整來形成最終影像。


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