成分定位和皮膚滲透可視化
從藥品和消費者健康產(chǎn)品到農(nóng)用化學(xué)品和油漆,霜劑、糊劑、凝膠、乳劑和片劑常見于眾多制造領(lǐng)域。為提高有效性以及產(chǎn)品性能和安全性,有必要了解產(chǎn)品中各成分之間的相互作用。具備能評估活性成分的結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性并對其輸送進(jìn)行可視化的技術(shù)對配方產(chǎn)品制造業(yè)而言具有重大價值。
成分分布可視化
受激拉曼散射(SRS)和相干反斯托克斯拉曼散射(CARS)可提供具有高空間和時間分辨率的無標(biāo)記化學(xué)信息,因此非常適合用于可視化配方產(chǎn)品的結(jié)構(gòu),包括監(jiān)測單一成分在使用期間的所帶來的結(jié)果(包括在使用期間監(jiān)測單一組分的命運)。通過選擇適當(dāng)?shù)睦灰?,可以從預(yù)先存在的單個成分的拉曼光譜(圖1左),或從獲取λ掃描生成的SRS光譜(見下文,以及圖3中的示例)進(jìn)行SRS對比,從而對單一成分進(jìn)行成像。
圖1:左:在532nm激發(fā)下獲得的石蠟(紅色)和水(藍(lán)色)的自發(fā)拉曼光譜。右:用SRS顯微鏡對商業(yè)水乳劑配方進(jìn)行成像,以顯示凡士林油相(紅色,2850 cm-1處的CH?鍵)vs水相(藍(lán)色,3400 cm-1處的O-H鍵)。通過簡單地將一小滴樣品置于兩個蓋玻片之間,準(zhǔn)備進(jìn)行正向SRS成像。
除了這些對比波數(shù)外,還應(yīng)在附近預(yù)期無拉曼強(qiáng)度的波數(shù)處獲取“非共振"控制圖像(見圖2中的示例),從而確保檢測到的信號基于拉曼光譜,并能識別任何雜散信號,如激光吸收產(chǎn)生的偽影。在各成分/相的所需波數(shù)下獲得圖像后,可將圖像合并成一個復(fù)合圖像,從而了解材料中不同成分之間的關(guān)聯(lián)性。除了SRS對比,還可通過使用二次諧波生成或熒光等方法來同時成像,獲得其他結(jié)構(gòu)信息。圖2中的圖像顯示了用SRS顯微鏡成像的防曬霜樣品中油vs水的相位分布,以及用SHG可視化的氧化鋅顆粒。
圖2:用SRS和SHG顯微鏡對防曬霜配方進(jìn)行成像,用正向SRS顯示油相vs水相,用epi-SHG顯示氧化鋅顆粒分布。
生成SRS光譜以提供化學(xué)和結(jié)構(gòu)信息
SRS光譜可通過執(zhí)行λ掃描來生成,在此期間,SRS圖像在泵浦光束的波長上以非常小的增量被捕獲,以生成跨越感興趣波數(shù)范圍的圖像棧。圖3顯示了在含有多種活性成分的皮膚用藥物配方上獲得的這種λ掃描圖像棧。當(dāng)泵浦光束掃過與拉曼光譜的指紋區(qū)相對應(yīng)的波長時,不同的成分依次受到激發(fā),因為其波數(shù)受到刺激。獲得這些圖像棧后,可立即選擇相關(guān)特征來生成感興趣區(qū)域(ROI)。從這些ROI中,通過繪制ROI SRS信號強(qiáng)度和泵浦光束波長(可轉(zhuǎn)換為波數(shù))的關(guān)系,生成SRS光譜。有時,為波長堆棧中所有圖像生成最大投影有助于在一張圖像中實現(xiàn)所有特征的可視化,確保不會遺漏任何重要特征。
皮膚用藥物配方的SRS λ掃描圖像堆棧。
圖3:左:皮膚用藥物配方的SRS λ掃描。從顯示的圖像棧中創(chuàng)建的最大投影圖像,注釋描述了ROI。在約2000 cm-1至1000 cm-1的范圍內(nèi),以泵浦光束的0.1 nm增量獲取圖像。右:各ROI的SRS光譜根據(jù)SRS信號強(qiáng)度和波長繪制而成。
從λ掃描中生成SRS光譜后,可立即將這些光譜與單一成分的自發(fā)拉曼光譜進(jìn)行比較。將光譜信息與圖像中的形態(tài)信息相結(jié)合,對配方的問題分析具有重大價值,如識別是否存在多晶、共晶或氧化產(chǎn)物。
皮膚中成分滲透的可視化
除了分析配方本身的特性外,SRS顯微鏡也可用于對單一成分使用后帶來的最終結(jié)果進(jìn)行可視化。例如,監(jiān)測化學(xué)品在皮膚中的滲透,這在藥物輸送和化學(xué)風(fēng)險評估中具有極其重要的應(yīng)用價值。圖4顯示了4-氰基苯酚給藥后皮膚的圖像。將組織冷凍切片,用SRS成像,以在2235 cm-1(品紅色)處通過腈基官能團(tuán)的對比來顯示這種化合物的分布。在2850 cm-1處使用CH2鍵振動模式(紅色)、在1666 cm-1處采用酰胺I(藍(lán)色)以及使用SHG通道的膠原蛋白分布(綠色),對皮膚結(jié)構(gòu)進(jìn)行可視化。
圖4:4-氰基苯酚給藥后的豬皮膚的正向SRS和Epi-SHG合成圖像。在2850 cm-1處使用CH2鍵振動模式(紅色)、在1666 cm-1處采用酰胺I(藍(lán)色)以及使用SHG通道的膠原蛋白分布(綠色),對皮膚結(jié)構(gòu)進(jìn)行可視化。在2235 cm-1處采用腈基官能團(tuán)顯示4-氰基苯酚的分布(品紅色)。*
由于SRS信號與濃度呈線性關(guān)系,因此有可能通過圖像分析提取某些定量信息,例如,化學(xué)物質(zhì)的相對濃度和皮膚深度。對于在同一共焦平面上成像的物理截面,該操作合理且簡單。然而,當(dāng)對三維標(biāo)本進(jìn)行成像時,必須對激光散射和隨著深度增加產(chǎn)生的吸收所致的信號損失進(jìn)行校正。
試圖對不含dute化學(xué)官能團(tuán)的化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行成像時,有時很難獲得特定的對比度。在這種情況下,對感興趣的分子進(jìn)行氘化,可幫助將峰值轉(zhuǎn)移到拉曼光譜的生物“沉默"區(qū)域,該區(qū)域的組織中幾乎無自然存在的信號。這種方法可便于對敏感和化學(xué)特異性成分進(jìn)行可視化,而無需引入會擾亂物理化學(xué)特性,從而擾亂藥代動力學(xué)特征的熒光基團(tuán)。另外,還可采用多變量數(shù)據(jù)分析方法,對不同成分進(jìn)行光譜拆分。
致謝
衷心感謝“分析化學(xué)信托基金"和“分析測量科學(xué)共同體"的支持。
*數(shù)據(jù)通過與英國巴斯大學(xué)的Richard Guy教授小組合作獲得。本研究的資金部分由美國食品藥品監(jiān)督管理局資助(1U01FD006533-01)。所有觀點不一定反映美國衛(wèi)生與公眾服務(wù)部的guanfang政策;提到任何商品名稱、商業(yè)慣例或組織也不一定獲得美國政府的認(rèn)可。
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