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如何從共聚焦圖像中去除自發(fā)熒光

更新時(shí)間:2023-03-09      點(diǎn)擊次數(shù):573

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自發(fā)熒光

了解自發(fā)熒光的常見(jiàn)原因,以及如何從您的共聚焦顯微鏡成像過(guò)程中去除它根據(jù)您的應(yīng)用,可能有任意數(shù)量的自發(fā)熒光來(lái)源,但幸運(yùn)的是,解決方案同樣也多種多樣——從改變您的介質(zhì)到使用熒光壽命成像和遠(yuǎn)紅區(qū)染料。









引言

熒光顯微鏡已經(jīng)che di改變了我們對(duì)生物學(xué)的理解。通過(guò)以高空間分辨率定位細(xì)胞內(nèi)特定分子事件,人們對(duì)從基因表達(dá)途徑到藥物相互作用的各個(gè)方面有了深入的了解。

隨著現(xiàn)代共聚焦顯微鏡技術(shù)的改進(jìn),其靈敏度也在提高。在共聚焦成像過(guò)程中,一個(gè)關(guān)鍵的因素是信噪比,背景噪音會(huì)掩蓋信號(hào)的微小變化。

在共聚焦顯微鏡中,噪音的最大來(lái)源之一是自發(fā)熒光。去除這種背景對(duì)于理解樣品中存在的信號(hào)的微小差異至關(guān)重要。在這篇綜述中,我們將探討如何通過(guò)一些快速修復(fù)方法和一些現(xiàn)代技術(shù)去除自發(fā)熒光,如熒光壽命成像。借助軟件和顯微鏡硬件方面的進(jìn)步,這些技術(shù)越來(lái)越容易使用。

自發(fā)熒光的原因

自發(fā)熒光有許多潛在的原因,在一個(gè)樣品中往往有多個(gè)來(lái)源。首先,細(xì)胞制劑本身可以是內(nèi)源性自發(fā)熒光的來(lái)源。一些常見(jiàn)的來(lái)源是NADH、黃素、脂褐素、膠原蛋白和彈性蛋白,以及植物樣品中的葉綠素和木質(zhì)素。換句話說(shuō),它們是很難消除的。

除了細(xì)胞增加了自發(fā)熒光外,在成像前處理樣品的方式也會(huì)引入額外的背景熒光。從處理試劑到封片介質(zhì),這可能是任何東西。在去除自發(fā)熒光之前,找到自發(fā)熒光的來(lái)源是很重要的。

消除自發(fā)熒光的方法

了解您的樣品

如果您遇到自發(fā)熒光的問(wèn)題,首先要做的是通過(guò)調(diào)查樣品來(lái)嘗試確定原因。當(dāng)您開(kāi)始實(shí)驗(yàn)時(shí),先選擇一個(gè)未標(biāo)記的對(duì)照品,以確定染色過(guò)程中是否有增加背景熒光。

了解您的自發(fā)熒光的光譜也很重要。這可以通過(guò)光譜掃描來(lái)確定。光譜掃描將有助于實(shí)驗(yàn)優(yōu)化和避免自發(fā)熒光的峰值。

優(yōu)化熒標(biāo)記

一旦您了解了自發(fā)熒光的光譜,下一個(gè)階段就是優(yōu)化熒光標(biāo)記選擇。如果自發(fā)熒光的光譜和您的熒光標(biāo)記的光譜高度重疊,那么您的信號(hào)很有可能會(huì)被自發(fā)熒光所掩蓋。在這種情況下,選擇一個(gè)光譜遠(yuǎn)離背景自發(fā)熒光的熒光標(biāo)記。例如,如果您的自發(fā)熒光是在光譜的藍(lán)色區(qū)域,將您的熒光標(biāo)記移到綠色或紅色區(qū)域。

選擇熒光團(tuán)時(shí),選擇新型探針,如Alexa Fluor、Dylight或Atto。這些染料往往更亮,更穩(wěn)定,并且激發(fā)和發(fā)射帶更窄,可以更容易地選擇您的熒光標(biāo)記的信號(hào)。如果您的顯微鏡能檢測(cè)到它們,遠(yuǎn)紅區(qū)染料是避免自發(fā)熒光問(wèn)題的有效方法,因?yàn)檫@些波長(zhǎng)在生物樣品中很少出現(xiàn)。檢測(cè)到遠(yuǎn)紅染料還有一個(gè)好處,就是能夠擴(kuò)大用于多色實(shí)驗(yàn)的通道數(shù)量。

選擇熒光標(biāo)記后,重要的是不要盲目地用說(shuō)明書(shū)上列出的濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。更多的時(shí)候,需要對(duì)熒光團(tuán)進(jìn)行滴定,在您的樣品上測(cè)試不同的濃度。這可以讓您看到哪種濃度能更有效地與背景區(qū)分,并減少自發(fā)熒光產(chǎn)生的干擾。按照制造商的說(shuō)明,創(chuàng)建一個(gè)熒光標(biāo)記的稀釋梯度,以涵蓋略低于和略高于推薦用量的范圍。用您的樣品測(cè)試這些稀釋液,以確定哪種稀釋液會(huì)給您帶來(lái)zui you xiao的信號(hào)。

優(yōu)化您的顯微鏡設(shè)置

共聚焦顯微鏡的設(shè)置對(duì)圖像中的可見(jiàn)信號(hào)發(fā)揮著重要的作用,包括自發(fā)熒光。利用這些設(shè)置的優(yōu)勢(shì),通過(guò)調(diào)整光譜檢測(cè),盡可能多地切斷自發(fā)熒光信號(hào)。根據(jù)顯微鏡的不同,有不同的方法,但最靈活的選擇是選擇一個(gè)白激光與光譜檢測(cè)器相配合。這樣,您可以精確調(diào)整到達(dá)樣品的光的波長(zhǎng),以及通過(guò)檢測(cè)器的波長(zhǎng)。通過(guò)這種方式,在選擇哪些信號(hào)被記錄在捕獲的圖像中時(shí),可以進(jìn)行非常精細(xì)的控制,并有足夠的機(jī)會(huì)消除自發(fā)熒光。

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圖1:當(dāng)比較自發(fā)熒光和熒光標(biāo)記的光譜時(shí),挑選一個(gè)與自發(fā)熒光信號(hào)不重疊的熒光標(biāo)記。

處理您的樣品以避免自發(fā)熒光

通常自發(fā)熒光不是來(lái)自樣品,而是來(lái)自成像前的處理方式。例如,封片介質(zhì)、組織培養(yǎng)基和實(shí)驗(yàn)室器皿都可能是自發(fā)熒光的來(lái)源。

如果您正在進(jìn)行活細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn),那么考慮在成像前用預(yù)熱的不含酚紅的培養(yǎng)基或透明的緩沖鹽水代替正常的培養(yǎng)基。除了pH指示劑酚紅(在440納米處被激發(fā)時(shí)具有高強(qiáng)度熒光)外,培養(yǎng)基和試劑(如FBS)可能含有許多蛋白質(zhì)和小分子,它們本身具有熒光信號(hào)--如果不去除它們,所有這些都會(huì)造成強(qiáng)烈的自發(fā)熒光背景。如果您決定將您的細(xì)胞換成一種新的培養(yǎng)基進(jìn)行活體成像,重要的是要注意這可能會(huì)引起細(xì)胞行為和表型的意外變化,所以根據(jù)您的研究?jī)?nèi)容,您可能需要先讓細(xì)胞適應(yīng)新的培養(yǎng)基。

您也可以測(cè)量一下您用同一顯微鏡設(shè)置的器皿的自發(fā)熒光,查看是否是自發(fā)熒光的來(lái)源。測(cè)量時(shí),請(qǐng)嘗試使用帶玻璃底的培養(yǎng)皿或?qū)iT(mén)用于去除自發(fā)熒光信號(hào)的玻璃底皿進(jìn)行成像。

在對(duì)暴露于化學(xué)品的活檢和組織樣本進(jìn)行成像時(shí)也會(huì)出現(xiàn)類似的問(wèn)題。一個(gè)常見(jiàn)的例子是消化道,如果它被暴露在抗生素(如四環(huán)素)中,會(huì)有大量的自發(fā)熒光,這些抗生素有強(qiáng)烈的熒光特征。在這種情況下,通過(guò)用緩沖鹽水che di沖洗或謹(jǐn)慎使用溶劑,可以很容易去除熒光。

如果您要固定細(xì)胞,固定方法會(huì)對(duì)自發(fā)熒光有很大影響??紤]用福爾馬林和戊二醛的替代品,并且在成像前盡量不要將固定的樣品存放太久,因?yàn)?/span>自發(fā)熒光會(huì)隨著時(shí)間的推移而增加

軟 件

雖然zui li xiang的方式是通過(guò)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)消除自發(fā)熒光,但有些時(shí)候這是無(wú)法實(shí)現(xiàn)的。在這些情況下,可以通過(guò)計(jì)算來(lái)解決您的自發(fā)熒光問(wèn)題。使用您的顯微鏡軟件或開(kāi)源解決方案,如ImageJ,可以分析含有自發(fā)熒光的像素,并嘗試從整個(gè)圖像中消除自發(fā)熒光[1]。但要注意的是,計(jì)算方法可能很復(fù)雜。有許多不同的方法和算法可供選擇,所以可以嘗試查看哪些方法xiao guo zui hao。重要的是要記住,這些方法往往會(huì)降低您的熒光體信號(hào)的強(qiáng)度以及自發(fā)熒光,所以要小心使用它們,并注意在提高與背景的對(duì)比度和降低信號(hào)強(qiáng)度之間進(jìn)行權(quán)衡。

固定后去除自發(fā)熒光

準(zhǔn)備好您的樣品并儲(chǔ)存在冰箱后,似乎任何自發(fā)熒光都會(huì)留在那里。雖然在樣品準(zhǔn)備階段消除自發(fā)熒光比較容易,但即使在這個(gè)過(guò)程的后期階段也肯定可以采取一些步驟。

有許多化學(xué)處理方法可以減弱自發(fā)熒光信號(hào)。其中一些是市面上可以買到的,而另一些則可以用普通的實(shí)驗(yàn)室化學(xué)品輕松制備,如peng qing hua na、蘇丹黑B、乙醇銨等[2,3]。

光漂白在顯微鏡中往往有負(fù)面的含義,在激光調(diào)得稍高的情況下,往往會(huì)在花費(fèi)大量時(shí)間尋找最佳圖像后失去熒光信號(hào)。然而,對(duì)于自發(fā)熒光,漂白可以發(fā)揮有益的幫助。在添加熒光團(tuán)之前,您可以用高強(qiáng)度LED光處理您的樣品,以漂白所有的背景自發(fā)熒。之后,您所選擇的熒光標(biāo)記應(yīng)該與漂白后的背景形成更強(qiáng)烈的對(duì)比[4]。

消除自發(fā)熒光的先進(jìn)方法

顯微鏡和熒光標(biāo)記技術(shù)在不斷進(jìn)步的同時(shí)也考慮到了自發(fā)熒光。有兩項(xiàng)創(chuàng)新在商業(yè)共聚焦顯微鏡中正變得越來(lái)越容易使用。

白光激

在減少自發(fā)熒光方面,白激光(WLL)具有很大的靈活性。首先,它們使您能夠精細(xì)地調(diào)整激發(fā)波長(zhǎng),以匹配您所選擇的熒光團(tuán),同時(shí)補(bǔ)充您的樣品的自發(fā)熒光特征。

白激光在選擇熒光團(tuán)時(shí)也給您大的靈活性,因?yàn)槔碚撋纤鼈兛梢宰屇谡麄€(gè)光譜范圍內(nèi)使用所有已知的熒光染料。波長(zhǎng)從440 nm一直到遠(yuǎn)紅端(790 nm),在處理自發(fā)熒光時(shí),激發(fā)新型遠(yuǎn)紅熒光標(biāo)記的能力特別有利,因?yàn)樽园l(fā)熒光更常見(jiàn)于光譜的藍(lán)色和綠色帶。

最后,基于光纖的WLL技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)脈沖激發(fā),因此,您可以在脈沖之間的非常短的間隔內(nèi)記錄熒光信號(hào)(計(jì)數(shù)光子)。這是時(shí)間相關(guān)單光子計(jì)數(shù)(TCSPC)的一個(gè)基本要求--熒光壽命分析的黃金標(biāo)準(zhǔn)方法。有了WLL,F(xiàn)LIM可以內(nèi)置于您的顯微鏡中,為減少自發(fā)熒光和提高圖像對(duì)比度提供了一個(gè)非常有效和相對(duì)簡(jiǎn)單的方法。

壽命成像

熒光壽命成像方法可用于消除自發(fā)熒光。壽命測(cè)量不是僅僅依靠特定波長(zhǎng)下的熒光強(qiáng)度,而是反映熒光團(tuán)在激發(fā)狀態(tài)下所花費(fèi)的時(shí)間,這通常是納秒級(jí)的時(shí)間。這可以發(fā)揮重要的作用,因?yàn)槟谋尘白园l(fā)熒光和您的熒光標(biāo)記有重疊光譜的幾率相對(duì)較高。然而,它們具有相同的壽命信號(hào)的幾率要小得多。這意味著壽命測(cè)量可以用來(lái)區(qū)分自發(fā)熒光和熒光標(biāo)記信號(hào),即使它們看起來(lái)在同一光譜范圍內(nèi)。以這種方式區(qū)分熒光信號(hào),意味著使用壽命測(cè)量可以從幾乎任何熒光信號(hào)中收集有意義的信息,甚至是自發(fā)熒光。雖然壽命測(cè)量在傳統(tǒng)上是一種相對(duì)復(fù)雜的技術(shù),但硬件和軟件的改進(jìn)使其更容易被納入任何共聚焦顯微鏡的工作流程。

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圖2:左邊的熒光顯微鏡圖像,沒(méi)有區(qū)分熒光信號(hào)和背景自發(fā)熒光。右邊的圖像使用FLIM來(lái)區(qū)分葉綠體中的自發(fā)熒光(藍(lán)色)和來(lái)自細(xì)胞膜的理想熒光信號(hào)(綠色)。


概述和結(jié)論

自發(fā)熒光不一定會(huì)毀掉您的實(shí)驗(yàn)。

但當(dāng)您只有有限數(shù)量的珍貴樣本時(shí),應(yīng)確保沒(méi)有任何東西會(huì)損害您的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的質(zhì)量。自發(fā)熒光是一種足以破壞您實(shí)驗(yàn)的常見(jiàn)現(xiàn)象。然而,從簡(jiǎn)單地替換您在樣品中使用的介質(zhì)一直到使用先進(jìn)的顯微鏡和檢測(cè)器,有許多種方法可以解決自發(fā)熒光。

針對(duì)自發(fā)熒光做好相關(guān)準(zhǔn)備是防止它影響您的實(shí)驗(yàn)的最好方法。通過(guò)采取相關(guān)的應(yīng)對(duì)措施,您可以在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中做出選擇,減少或wan quan消除背景熒光。



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