激光顯微鏡與傳統(tǒng)寬場(chǎng)顯微鏡相比,具有高清晰度、高分辨率、高靈敏度等特點(diǎn),在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用廣泛,成為了該領(lǐng)域重要的成像工具。為什么共聚焦能得到如此多的寵愛(ài),它又有哪些優(yōu)勢(shì)呢?本文列舉了三方面來(lái)論述共聚焦的優(yōu)勢(shì)。
只收集焦平面上的信號(hào),使圖像由模糊變清晰
樣品比較厚的時(shí)候,普通寬場(chǎng)熒光顯微鏡只能夠觀察到整體的樣品結(jié)構(gòu),而共聚焦顯微鏡卻可以展現(xiàn)樣品輪廓及內(nèi)部結(jié)構(gòu)。
那么共聚焦顯微鏡是如何實(shí)現(xiàn)這一優(yōu)勢(shì)的呢?這就要?dú)w功于共聚焦的關(guān)鍵硬件—針孔(pinhole),如圖二所示,它是檢測(cè)器前面的一個(gè)小孔,放置在與樣品焦面共軛的光學(xué)平面上。當(dāng)激發(fā)光照射樣品時(shí),焦面和非焦平面上的樣品區(qū)域都會(huì)被激發(fā)而產(chǎn)生熒光信號(hào),調(diào)節(jié)合適的針孔大小(通常為1 Au),使焦面上的熒光信號(hào)(綠色虛線(xiàn))可以通過(guò)針孔到達(dá)檢測(cè)器,而非焦平面的熒光信號(hào)(紅色和藍(lán)色虛線(xiàn))不能通過(guò)針孔到達(dá)檢測(cè)器。通過(guò)增加硬件針孔,使共聚焦在不改變普通熒光顯微鏡的制片方法的前提下,得到了清晰的高質(zhì)量圖像。
可連續(xù)獲取不同焦平面的信號(hào),實(shí)現(xiàn)三維重組
由于針孔的存在,我們能夠只獲取到焦平面上的信號(hào),得到高分辨率的二維圖像。連續(xù)調(diào)節(jié)Z軸位置,就能夠得到不同Z軸位置的二維圖像,獲得一系列連續(xù)的“光學(xué)切片"圖像。獲得這些光學(xué)切片后,可使用儀器軟件配備的3D模塊進(jìn)行三維圖像的重組,構(gòu)建出清晰的3D圖像。這種無(wú)損傷的、連續(xù)的光學(xué)切片圖像的采集,實(shí)現(xiàn)了“細(xì)胞CT"的功能。
應(yīng)用于共定位(Co-localization)研究
共定位結(jié)果的精準(zhǔn)度與圖像的分辨率密切相關(guān),所以我們?cè)谶M(jìn)行共定位實(shí)驗(yàn)時(shí)需要選擇更高分辨率的成像方式。共聚焦顯微鏡相比于傳統(tǒng)顯微鏡以其高分辨率的優(yōu)勢(shì),成為共定位研究的得力工具。
由于衍射極限的存在,激光顯微鏡常規(guī)共聚焦光學(xué)分辨率在200nm左右,當(dāng)我們需要觀察大于200nm的結(jié)構(gòu)時(shí),共聚焦就能夠準(zhǔn)確判斷其共定位程度。如果需要進(jìn)行共定位分析,可以選用共聚焦軟件中配備的共定位分析模塊。
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