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共聚焦顯微鏡的分辨率受哪些因素影響

更新時間:2022-08-29      點(diǎn)擊次數(shù):801
  共聚焦顯微鏡,最常見的是共聚焦激光掃描顯微鏡(CLSM)或激光共聚焦掃描顯微鏡(LCSM),是一種光學(xué)成像技術(shù),可通過使用空間針孔來阻擋散焦光來提高顯微圖像的光學(xué)分辨率和對比度。在圖像形成中。捕獲樣品中不同深度的多個二維圖像可重建三維結(jié)構(gòu)(此過程稱為光學(xué)切片)。該技術(shù)廣泛用于科學(xué)和工業(yè)界,典型的應(yīng)用是生命科學(xué)、半導(dǎo)體檢查和材料科學(xué)。
 
  共聚焦顯微鏡是一種掃描成像技術(shù),通過與其他掃描技術(shù)(如掃描電子顯微鏡SEM)進(jìn)行比較,可以解釋所獲得的分辨率。CLSM的優(yōu)點(diǎn)是,例如在AFM或STM中,不需要將探針從表面上懸垂納米級,例如,通過在表面上用細(xì)小進(jìn)行掃描即可獲得圖像。從物鏡到表面的距離(稱為工作距離)通??膳c常規(guī)光學(xué)顯微鏡相媲美。它隨系統(tǒng)光學(xué)設(shè)計的不同而變化,但是典型的工作距離是幾百微米到幾毫米。
 
  在共聚焦顯微鏡CLSM中,樣品由點(diǎn)激光源照射,每個體積元素都與離散的散射或熒光強(qiáng)度相關(guān)。在此,掃描體積的大小由光學(xué)系統(tǒng)的光斑大小(接近衍射極限)決定,因為掃描激光的圖像不是無限小的點(diǎn)而是三維衍射圖案。此衍射圖樣的大小及其定義的焦點(diǎn)體積由數(shù)值孔徑控制系統(tǒng)的物鏡和所用激光的波長。這可以看作是使用廣角照明的傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡的經(jīng)典分辨率極限。但是,通過共聚焦顯微鏡,甚至可以改善寬視場照明技術(shù)的分辨率極限,因為可以關(guān)閉共聚焦孔以消除更高階的衍射圖。例如,如果針孔直徑設(shè)置為1艾里單位那么只有一階衍射圖樣會通過孔徑到達(dá)檢測器,而更高的階數(shù)會被遮擋,從而以稍微降低亮度的代價提高了分辨率。在熒光觀察中,共聚焦顯微鏡的分辨率極限通常受信噪比限制由熒光顯微鏡中通??捎玫纳倭抗庾右鸬摹?梢酝ㄟ^使用更靈敏的光電探測器或通過增加照明激光點(diǎn)光源的強(qiáng)度來補(bǔ)償這種影響。增加照明激光的強(qiáng)度可能會對目標(biāo)樣品造成過度漂白或其他損壞,特別是對于需要比較熒光亮度的實(shí)驗。當(dāng)對屈光不同的組織(例如植物葉片的海綿狀葉肉或其他包含空氣的組織)進(jìn)行成像時,通常會損害共聚焦圖像質(zhì)量的球面像差。但是,通過將樣品安裝在光學(xué)透明,無毒的全氟化碳(如全氟萘烷)中,可以降低此類像差容易滲入組織,其折射率幾乎與水相同。


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